Deoxyribonuclease I – DNase I

Beschreibung:
Deoxyribonuklease I (DNase I) aus Rinderpankreas ist eine Endonuklease (Glykoprotein), die die Phosphodiesterbindung in der DNA bevorzugt hinter Pyrimidinnukleotiden spaltet. Daraus ergibt sich ein Polynukleotid mit einem 5′-Phosphat und eine freie OH-Gruppe in Position 3′. DNase I schneidet einzelsträngige und doppelsträngige DNA sowie Chromatin. Die Spezifität der Enzymreaktion (Einzelstrang-‚Nicks‘ versus Doppelstrang-Brüche) wird durch die verfügbaren Ionen bestimmt. In Anwesenheit von Mg²⁺ werden Einzelstrang-‚Nicks‘ produziert und bei Mn²⁺ Doppelstrang-Brüche. Das pH-Optimum des Enzyms liegt bei 7,8 und es wird durch zweiwertige Metallionen aktiviert. Maximale Aktivierung bedarf der Anwesenheit von Mg²⁺ und zusätzlich Ca²⁺. Calcium-Ionen (5 mM) schützen DNase I vor proteolytischem Verdau. Eine Hemmung wird durch Citrat erzielt, wenn die Aktivierung durch Magnesium erfolgte, nicht aber, wenn Mangan als Aktivator fungierte. Desweiteren hemmen Chelatoren wie EDTA und SDS oder β-Mercaptoethanol DNase I.
Das Enzym findet in molekularbiologischen Techniken Anwendung zum Verdau von DNA, wie der RNA-Reinigung , dem ‚Setzen‘ von ‚random nicks‘ für die ’nick translation‘, ‚Footprint‘-Experimenten oder Chromatin-Untersuchungen.
Die Einheit ist nach Kunitz als die Menge an Enzym definiert, die einen Anstieg der Extinktion bei 260 nm von 0,001 pro Minute bei 25°C und pH 5,0 bewirkt. Deoxyribonuklease I ist z. B. leicht löslich in 0,15 M Natriumchlorid oder in Reaktionspuffer (z. B. 50 mM Tris · Cl, pH 7,5; 10 mM MgCl₂ (Einzelstrang-‚Nicks‘) bzw. 10 mM MnCl₂ (Doppelstrang-Brüche); 50 μg/ml BSA;). Zur Lagerung kann DNase I in 50 % Glycerin (w/v); 20 mM Tris · Cl, pH 7,5; 1 mM MgCl₂ gelöst werden. Die Konzentration sollte aus Stabilitätsgründen mindestens 1 mg/ml betragen (Die maximale Löslichkeit beträgt 10 %). In dieser Lösung ist DNAse I mindestens ein Jahr stabil. In lyophilisierter Form ist sie 2 – 5 Jahre bei +4°C stabil. Wenn Protease-frei, verliert DNase I in Lösung bei pH 5 – 7 bei 62°C für 5 Stunden kaum an Aktivität. Das Enzym kann durch Hitze (10 Minuten) bei 99°C inaktiviert werden.

RNase-freie DNase I: Man löse 1 mg/ml DNase I in 0,1 M Iodessigsäure plus 0,15 M Natriumacetat bei einem finalen pH-Wert von 5,3. Die Lösung wird dann für 40 Minuten auf 55°C erhitzt und anschließend gekühlt. Zuletzt wird 1 M CaCl₂ mit einer Endkonzentration von 5 mM zugegeben. In kleinen Aliquots bei -20°C lagern (gemäß Ref. 2 Seite 3.12.6 Supplement 8).

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